克倫特羅elisa試劑盒說明書（二） 
接著上一篇克倫特羅elisa試劑盒說明書（一）的相關對于試劑盒說明的簡述，下面本章繼續對克倫特羅試劑盒進行相關說明。
六、自備實驗器材 1． 酶標儀 2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl 3． 洗板機 4． 37℃孵育箱 5． 超純水，去離子水 6． 一次性稀釋用聚丙烯試管
七、樣本收集及儲存
1. 尿液、血清、血漿樣本不用處理，如果樣本渾濁需過濾或3000g以上離心15min處理。 2. 組織樣本處理：取搗碎樣本5g，加入20ml，50mmolHCL振動1.5h，稱取5g均質物，加入離心管，10000r/min離心15min。取上清至另一個離心管中，加1molNaOH 300ul，混合15min。加入4ml 500mmol KH2PO4(PH3.0),迅速混勻置于4℃冰箱保存1.5h。10000r/min離心15min，分離上清備用。 3. 飼料處理：用研缽研碎飼料樣本，稱取2.0±0.05g研碎的樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，加入2ml 1M 鹽酸溶液，加入16ml去離子水用均質器進行均質；
用渦旋儀渦動3min，放振蕩器上振蕩15min；3000g以上，離心20min，轉移出全部上清液至10ml聚苯乙烯離心管中，并加入2ml 1M氫氧化鈉溶液混合均勻，檢查pH值是否在6.5-7.5之間；（用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH值）；3000g以上，離心20min，取100ml上清液至2ml干凈的聚苯乙烯離心管中，加入900ml去離子水混合均勻。取50ul用于分析。 注意事項：如果樣本中的靶標物檢測濃度高 于標準品的最高值，請將樣品做適當倍數稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數。 
八、試劑準備
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下復溫。 2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用超純水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋 成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。 3. 抗體工作液配制：抗體溶液與稀釋液比例為1:9,例如向4.5ml抗體稀釋液中加入500ul抗體溶液，混勻使用。 4. 標準品梯度稀釋：標準品S6為即用型濃度為7290pg/ml，按照濃度為S5:2430pg/ml、S4:810pg/ml、S3:270pg/ml、S2:90pg/ml、S1:30pg/ml進行稀釋，具體操作如下圖所示。 
九、檢測步驟
1 按照實驗設計，在標準品與樣本孔中加樣50ul，加入50ul抗體工作液，再加入100ulHRP反應液，空白對照不加 2 37℃避光孵育45min 3 棄去液體，用洗滌液清洗4次，每次每孔至少加洗滌液300ul，洗完后吸水紙上拍干 4 每孔加入底物A、B各50ul，37℃避光孵育20min，顯色淺可適當延長孵育時間 5 加入終止液50ul，10min內在450nm波長處測OD值
十、結果判斷
1. 用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。 2. 計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值 3. 以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中克倫特羅含量可通過對應OD 值由標準曲線換算出相應的濃度。 4. 若標本 OD 值超出標準曲線范圍，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數。
十一、參數表征
1.數據及標準曲線
| Concentration(pg/ml) | OD1 | OD2 | 空白 | 0 | 0 | 0 | S1 | 30 | 1.278 | 1.298 | S2 | 90 | 1.174 | 1.183 | S3 | 270 | 1.091 | 1.102 | S4 | 810 | 0.884 | 0.892 | S5 | 2430 | 0.549 | 0.555 | S6 | 7290 | 0.272 | 0.276 |
2. 準確度：標準品線性回歸與預期濃度相關系數R>0.95
4. 檢測范圍：30-7290pg/ml(如超出檢測范圍，需將樣本稀釋后檢測) 5. 靈敏度：≤30pg/ml 4 特異性：不與其他可溶性結構類似物交叉反應 5 重復性：變異系數≤15% 6 儲存條件：2-8℃冷藏 7 有效期：6個月
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